Title Biomaterijali na temelju kitozana i hidroksiapatita supstituiranog metalnim ionima za primjene u tkivnom inženjerstvu Title (english) Biomaterials based on chitosan and metal-ion-substituted hydroxyapatite for tissue engineering applications Author Antonia Ressler Mentor Hrvoje Ivanković (mentor)Mentor Inga Urlić (mentor)Committee member Krešimir Košutić (predsjednik povjerenstva)Committee member Juraj Šipušić (član povjerenstva)Committee member Zdravko Schauperl (član povjerenstva)Granter University of Zagreb Defense date and country 2020-11-13, Croatia Scientific / art field, TECHNICAL SCIENCES Universal decimal classificationUDC ) 66 - Chemical technology. Chemical and related industries Abstract Starenje ljudi je prirodan biološki proces i često je popraćen oštećenjima i bolestima koštanog tkiva koje je moguće liječiti. Inženjerstvo koštanog tkiva temelji se na primjeni nosača za poticanje obnove kosti pomoću okolnog tkiva, ili primjeni nosača kao „predloška za isporuku“ ugrađenih koštanih stanica i tkiva dobivenih in vitro. Nosač za primjenu u inženjerstvu koštanog tkiva mora biti biokompatibilan i netoksičan, treba oponašati visokoporoznu strukturu prirodne kosti, imati odgovarajuća mehanička svojstva te pritom podržavati rast stanica i obnovu koštanog tkiva. Nosač mora imitirati prirodno koštano tkivo koje je građeno od karbonatnog hidroksiapatita s manjkom kalcijeva iona te organske matrice. Kalcijevi fosfati pripravljeni iz prirodnog izvora (ljuske jajeta, školjke, sipina kost, koralji) pokazuju fizikalno-kemijska svojstva slična prirodnom mineralnom tkivu te su bolje prihvaćeni od strane ljudskog tijela u odnosu na materijale dobivene iz sintetskih izvora.
Zbog mogućeg štetnog utjecaja faktora rasta korištenih u regenerativnoj medicini, današnja istraživanja se usmjeruju na supstituciju kalcijevih fosfata metalnim ionima koji imaju slično djelovanje kao faktori rasta te se prirodno nalaze u koštanom tkivu. Kako bi se omogućila regeneracija koštanog tkiva, potrebno je pripraviti nosač visokoporozne strukture čija je brzina razgradnje jednaka brzini obnove koštanog tkiva. U ovom doktorskom radu pripravljeni su kalcij-fosfatni sustavi supstituirani (0, 1, 5 i 10 mol%) sa stroncijevim (Sr2+), selenitnim (SeO3 2-), magnezijevim (Mg2+) i cinkovim (Zn2+) ionima metodom precipitacije primjenom prirodnog prekursora kalcijevih iona. Kako bi se ispitala toplinska stabilnost, uzorci su toplinski obrađeni na 1200 °C. Mineraloški sastav sintetiziranih i žarenih kalcij-fosfatnih sustava određen je rendgenskom difrakcijskom analizom koja potvrđuje nastajanje hidroksiapatita (HAp) i oktakalcijeva fosfata pentahidrata (OCP). Pomoću računalnog programa DIFFRAC.SUITE TOPAS V.5.0 određeni su parametri elementarnih ćelija i faktor zauzetosti kalcijevih atoma u kristalnoj rešetci HAp-a, OCP-a i β-trikalcijeva fosfata (β-TCP), koristeći Rietveldovu metodu utočnjavanja. Morfologija nastalih kalcijevih fosfata istražena je pretražnim elektronskim mikroskopom (SEM) i pokazuje smanjenje veličine kristala kao posljedicu supstitucije metalnim ionima. Kemijski sastav ispitan masenom spektroskopijom s induktivno spregnutom plazmom potvrđuje prisutnost metalnih iona u kalcij-fosfatnim fazama. In vitro test topljivosti uzoraka ispitan u simulirajućem biološkom mediju ukazuje na bolju topljivost materijala pripravljenih iz prirodnog izvora i supstituiranih metalnim ionima nego li onih pripravljenih iz sintetskog izvora. Pri simulirajućim biološkim uvjetima dolazi do transformacije manje stabilnih faza OCP-a i amorfnog kalcijevog fosfata u termodinamički stabilniji HAp, slično procesima u prirodnom koštanom tkivu. Pripravljene su visokoporozne strukture (nosači) na temelju kitozana i HAp-a supstituiranog metalnim ionima (Sr2+, Mg2+, Zn2+ i SeO3 2-) metodom toplinski inducirane fazne separacije uz naknadno geliranje i ekstrakciju. SEM analizom potvrđena je visokoporozna struktura s poroznošću > 70 % i veličinom pora u rasponu 50 ‒ 250 μm. Analiza citotoksičnosti i vijabilnosti ljudskih embrionalnih bubrežnih stanica potvrđuje necitotoksičnost ispitanih nosača te dobru vijabilnost nasađenih stanica. Diferencijacija ljudskih matičnih stanica iz koštane srži u koštane stanice na pripravljenim nosačima potvrđena je određivanjem ekspresije gena (alkalna fosfataza, koštani sijaloprotein i protein dentalnog matriksa) metodom lančane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu.
Abstract (english) The aging of the human population results in frequent damage and diseases of bone tissue and it is a challenge to meet their treatment needs. Bone tissue engineering is based on the use of a scaffold to stimulate bone growth of surrounding tissue or the use of a scaffold as a template for delivery of pre-seeded bone cells and tissue obtained in vitro. The scaffold has to be biocompatible and non-toxic, it should mimic the highly porous structure of natural bone, have suitable mechanical properties, while supporting cell growth and tissue regeneration. The scaffold must mimic natural bone tissue that is composed of carbonated calcium-deficient hydroxyapatite and organic matrix. Calcium phosphates prepared from a natural source (e.g. eggshells, shells, cuttlefish bone, corals) exhibit similar physicochemical properties to natural bone mineral and are better accepted by the human body compared to calcium phosphates obtained from a synthetic source. Due to the potential negative effect of growth factors used in regenerative medicine, studies are focused on the calcium phosphate substitutions with metal ions present in bone tissue, which have a similar effect as growth factors. In order to allow bone tissue regeneration, scaffolds should have a highly porous structure with a degradation rate similar to bone tissue regeneration that can be obtained by using polymers. In this doctoral thesis, calcium phosphates substituted (0, 1, 5 i 10 mol%) with strontium (Sr2+), selenite (SeO3 2-), magnesium (Mg2+) and zinc (Zn2+) ions have been prepared by using wet precipitation method from the biogenic source. In order to determine thermal stability, prepared calcium phosphates have been heat treated at
1200 °C. Phase analysis of as-prepared calcium phosphate, determined by X-ray diffraction analysis, confirmed precipitation of hydroxyapatite (HAp) and octacalcium phosphate pentahidrate (OCP). The software DIFFRAC.SUITE TOPAS V.5.0 was employed for Rietveld refinements to determine cell parameters and occupancy factors of HAp, OCP and β-tricalcium phosphate (β-TCP). The morphology of the substituted calcium phosphates crystals, determined by the scanning electron microscope (SEM), indicates a decrease in crystal size due to substitution with metal ions. The chemical composition of the as-prepared powders determined by inductively coupled plasma mass spectroscopy confirms the substitution of metal ions in the crystal lattice of the precipitated calcium phosphates.
The in vitro solubility test of the samples tested in the simulating biological solution indicates a better solubility of materials prepared from biogenic sources and substituted with metal ions than the samples prepared from a synthetic source. Under simulating biological conditions, the unstable OCP and amorphous calcium phosphate transformed into thermodynamically more stable HAp as it occurs in natural bone tissue. Highly porous structures (scaffolds) based on chitosan and hydroxyapatite substituted with metal ions (Sr2+, Mg2+, Zn2+ and SeO3 2-) were prepared via freeze gelation technique. A highporous structure with a porosity of > 70 % and pore size in the range of 50 ‒ 250 μm was confirmed by SEM. Cytotoxicity and viability assay performed on human embryonic kidney cells has confirmed non-cytotoxicity and good proliferation of seeded cells. Differentiation of human bone marrow stem cells to osteoblast cells has been confirmed by the expression of osteogenic genes (alkaline phosphatase, bone sialoprotein and dental matrix protein) determined by real-time polymerase chain reaction.
Keywords
diferencijacija
hidroksiapatit
kitozan
matične stanice
metalni ioni
nosač
Rietveldova metoda utočnjavanja
supstitucija
Keywords (english)
differentiation
hydroxyapatite
chitosan
stem cells
metal ion
scaffold
Rietveld refinement
substitution
Language croatian URN:NBN urn:nbn:hr:149:302151 Promotion 2020 Project Number: IP-2014-09-3752 Study programme Title: Chemical Engineering and Applied Chemistry - Doctoral course Type of resource Text Extent 114 str. ; 30 cm File origin Born digital Access conditions Access restricted to students and staff of home institution Terms of use Created on 2023-06-05 09:07:25
